010-83890401(北京)
技术资料 联系我们 在线咨询

电   话:010-83890401

电   话:010-53040922

网   址:www.bjytxc.net

邮   箱:sales@bjytxc.net

地   址:北京市丰台区纪家庙8号天丰大厦433室

您当前所在位置:主页 > 技术资料

抗体标记与检测指南
发表时间:2017-2-15 14:12:43 浏览次数:

科 技文献中有很多抗体标记方法指南,我 们往往难以选择最佳方法。本 指南可以帮助您更好的理解标准化学标记方法及它们的优缺点,同时还介绍了 Lightning-Link一步法抗体标记技术。该 技术极大简化了抗体标记步骤,利 用该技术标记抗体不需要您具备太多化学方面的知识,并 且手头操作时间仅需短短的30秒!

抗体与标记物

在多种免疫实验(流式细胞术, ELISA, western blotting, 免疫组化等)中,抗 体被广泛应用于检测和定量抗原。直 接识别抗原的抗体被称为一抗(primary antibody),赋予检测的特异性。大 多数免疫检测中还需加入标记物,赋予实验可检测性。标记物包括有机染料、荧光蛋白、有色微粒和酶。

直接检测法 Vs.间接检测法

包 含标记物的免疫检测一般有直接法和间接法两种形式。直接检测法中,标 记物通过共价键直接连接到一抗上。而对于间接检测法,标 记物则是共价连接到与一抗特异性结合的二抗上。间接法检测包括两步:第一步,用 未标记的一抗进行孵育,抗体与抗原结合(若存在抗原),洗去未结合的抗体(一般3~5次),第 二步则是加入标记二抗孵育(通常1小时),洗 涤去掉未结合的二抗,然 后量化结合在一抗上的标记物。

在直接法中,标 记物直接与一抗共价结合,因 此仅需与含有抗原的样本孵育这一步骤,而且只需一次洗涤,而 间接法则需要两轮孵育与洗涤步骤。直 接法简化了试验的流程,降低了试验的变异性,增加了数据的可靠性。然 而一抗的共价修饰可以导致抗体亲和力的改变,这 种情况的出现与标记二抗带来的非特异性结合的问题相比而言,显得无关紧要。下 表列举出了直接法与间接法的主要优缺点比较。


表.直 接法与间接法的比较

方法

优点

缺点

直接法

操作简单,结果可靠;

仅需使用一抗,检测快速;

无 二抗的非特异性结合。

由 于标记可能导致一抗的免疫反应性降低;

信号放大作用较弱。

间接法

一 抗含有多个标记二抗可结合的表位,因而灵敏度升高,信号放大作用较强。

二 抗可能发生非特异性结合;

孵育及洗涤步骤增多。


既 然直接标记法具有很多优点,但 为何众多的免疫分析仍采用间接法呢?原 因是市场上带有标记的一抗较少,而 且直接标记一抗较困难,这 在过去也许是您的困扰,但 是当您读到本篇指南的最后时就会对抗体标记充满信心。

 

抗体标记方法

您 仅需理解基本的化学原理,哪些基团发生反应,根 据化学结合物的种类去选择合适的试剂,而 不需要纠结化学结构和完整的化学名称。抗体和所有蛋白一样,是 由氨基酸残基组成的。蛋白的氨基基团(N-末 端及赖氨酸残基的侧链)通 常被用于共价链接标记物。尽 管在文献中报道了多种多样的标记方法和成百上千的化学修饰试剂,然 而实际上只有少数重要的方法和试剂。无论何种方法,几 乎毫无例外的都是将标记物共价连接到抗 体分子的赖氨酸残基上。

以 下是几种主要的抗体标记方法:

1.琥珀酰酯 (NHS)法

当 使用荧光染料标记时,通常可购买内配有NHS琥珀酰酯(也称为琥珀酰亚胺酯)的活化标记物。在适当条件下,活 化的染料可与抗体分子反应(抗 体分子通常含有多了赖氨酸基团)而形成结合物。根 据标记抗体和游离染料的大小不同,过 量的活性染料可通过层析法去掉,纯 化的步骤会导致一部分标记抗体的损失,但 是为了避免实验的高背景,这 些纯化步骤是必要的。

2.碳二亚胺(Carbodiimides)法

这类试剂(常见的如EDC)在 氨基和含羧基的分子间形成共价连接。碳二亚胺活化羧基,活 化的中间体随后被氨基(抗 体分子的赖氨酸残基)吸附。碳 二亚胺通常用于连接抗体和羧化的颗粒(如乳胶颗粒、磁珠),以 及其他羧化的表面如微孔板。碳 二亚胺很少用于将蛋白标记物偶联到抗体上,因 为这两种分子都含有氨基(赖氨酸)和羧基。大 多数碳二亚胺试剂都不溶于水,因 此它们主要用于有机合成化学,比如生产NHS活性染料。真正用于蛋白/抗 体标记的碳二亚胺试剂为EDC(也称为EDAC),常 以盐酸盐的形式出售。

3.过碘酸钠(Sodium periodate)法

过 碘酸钠是一种用于活化辣根过氧化物酶的强氧化剂。这 种过碘酸盐与糖链反应产生能与抗体的赖氨酸残基反应的醛基。由于HRP分 子本身含有很少的赖氨酸,因 而相对容易获得抗体-HRP结合物,且无明显的HRP多聚化发生。该 方法的缺点是赖氨酸和醛基结合物的形成是可逆的,只 有在硼氢化钠还原剂的作用下才能稳定,然 而硼氢化钠有一定的危险性。

4. 异硫氰酸盐(Isothiocyanate)法

该 方法值得特别一提是因为FITC(异硫氰酸荧光素)的重要意义。FITC作 为抗体和蛋白的标记物已使用了很多年。异硫氰酸盐较NHS琥珀酰亚胺酯稳定,因 此在保存中不易分解,但 是与抗体的反应性较差。FITC不溶于水,须溶于有机溶剂。该 方法的局限性在于反应需在PH9.5或更高的条件下进行,否 则标记反应会非常缓慢,然 而一些单克隆抗体在高PH条件下可能会被破环。

5.异(基)双功能试剂 (Heterobifunctional reagents)

当标记物为蛋白分子(如碱性磷酸酶AP、藻红蛋白PE)时,由 于抗体和标记分子都含有大量赖氨酸残基,因 此标记流程略为复杂,可 能发生预期外的其他反应。在这种情况下,通 常需要对其中一个分子(如抗体)的 一些赖氨酸进行修饰,以 此创造一个新的反应基团(X),而 标记物上的赖氨酸作为另一个反应基团(Y)。当 抗体与标记物混合时,利用双功能试剂引入Y基团,随之与X基团发生反应,从 而形成异二聚体结合物(即标记抗体)。该 方法的主要缺点是标记前需要一些分离步骤将X标签结合到抗体上,这 些分离步骤对标记反应是不利的。

缓冲液及添加物--抗体标记的关键因素

抗 体溶液中除抗体蛋白分子外,可 能还含有少量其他物质如缓冲液、盐、或其他蛋白及添加物。添 加物对不同标记方法的影响程度不同,但 绝大多数的标记抗法都是利用抗体分子上的赖氨酸残基,因 此在标记反应中应避免加入含有伯胺的缓冲液或添加物。有时,标 记反应前需要重新纯化抗体,尤 其当抗体中含有稳定蛋白(BSA)或低分子量物质(叠氮化钠、Tris、甘氨酸)时。甘氨酸和Tris缓 冲液常用来纯化和中和抗体,最 后加入叠氮化物来防止微生物的滋生。纯化实验中常用低PH值 的柠檬酸洗脱抗原亲和柱上的抗体,然 而柠檬酸会对碳化二亚胺参与的反应产生严重的干扰。因此,纯 化过的抗体在标记前需要进行透析。需要特别注意的是,透析时如能更换2-3次缓冲液,那 么去除小分子杂质的效率更高。这 并不意味着您需要准备3倍 或更大量的缓冲液一次性来透析,恰恰相反,多 次透析延长了透析的时间,从 而达到更好的杂质去除效果。如用1L的缓冲液透析3次的效果远比用5L的 缓冲液透析一次的效果好。如 果透析后需要加入叠氮化合物,尽 可能使用最低的浓度(如0.02%)或 者将抗体以浓缩形式保存。例如,在5mg/ml 抗体中加入0.02%叠氮化物,若后续标记实验使用1mg/ml 抗体时,叠 氮化物的浓度则降低为0.004%;然而如果将0.1% 叠氮化物加入0.5 mg/ml抗体溶液中,毫 无疑问会对标记反应产生严重的干扰。

抗体浓度及纯度

大 多数标记反应对抗体都有一个纯度要求(如>90%,最好>95%)和浓度要求(至少0.5mg/ml)。市 售的许多商业化抗体一般都是适用于标记的纯化形式,但 并非所有情况都如此,有 些抗体常以杂交瘤组织培养上清(TCS)、腹 水或血清等形式出售。TCS通 常含有多种其他蛋白和培养基营养物质(如氨基酸),这 对于标记是个非常大的问题。如果您使用的是TCS,那么纯化(如过蛋白A柱)步骤则是必需的。腹 水和血清原液中的抗体浓度较TCS中的抗体浓度高,但 它们同样也是不纯的,含 有高浓度的干扰物质,进 一步的纯化往往也是必要的。

上 述介绍了最常用的传统标记方法以及每种方法的优势和劣势。下 面要介绍一种新式的标记方法(Lightning-Link®),该 方法相比传统方法有很多优势。
友情链接:    六福彩票手机版   恒大彩票开奖网   乐购彩票主页   乐购彩票登陆   六福彩票网址